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單克隆抗體的融合過程

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　　單克隆抗體融合的方法很多，常用的有轉動法和離心法。融合時脾細胞和骨髓瘤細胞的比例為1:1至10:1不等。3:1或5:1*為常用。
　　1．試劑與材料
　　(1)供融合用的脾細胞及骨髓瘤細胞。
　　(2)1640培養液100ml。
　　(3)完全1640液100ml。
　　(4)2.5%FCS－1640液50ml。
　　(5)HAT培養液100ml。
　　(6)50%PEG：取分子量4000，高純度的（日本進口或Serva）PEG10g放入25ml瓶中高壓**，使用前用預熱于40℃的1640液10ml等量（W/V）混合，以酚紅檢查pH，一般不必調pH。如pH有改變，可用HCl或NaHCO3調整。
　　(7)10ml和50ml的**沉淀管或瓶。
　　(8)40孔塑料培養盤。
　　2．操作方法
　　⑴準備好脾細胞。
　　⑵在50ml沉淀管中混合108脾細胞和107小鼠骨髓瘤細胞，并加入50ml2.5%FCS－1640液。
　　⑶室溫400g離心3min，使細胞沉淀。
　　⑷移去上清液。
　　⑸輕敲管底部，使沉淀流動，把沉淀管放于40℃水浴中，使其達融合溫度。
　　⑹加預熱至40℃的50%PEG0.8ml，用1ml吸管緩慢滴加，邊加邊搖沉淀管，肉眼觀察可見有顆粒出現，滴加過程要求持續2min。
　　⑺加1ml1640液，邊加邊搖動，持續1min。
　　⑻重復⑺一次。
　　⑼加1ml1640液，邊加邊搖動，持續0.5min。
　　⑽重復⑼一次。
　　⑾加1640液15ml。
　　⑿室溫，400g離心1min，使細胞沉淀。
　　⒀去上清，輕敲管底部，加25ml含有HAT的完全1640液。
　　⒁往已于前一日種有飼養細胞的40孔塑料培養盤中滴加融合的細胞液，每孔1滴（約0.05ml）。
　　⒂輕搖后，放入5%CO2飽和濕度的37℃溫箱中培育。
　　⒃第3、6、9、10日換入含HAT的完全1640培養液。注意輕輕吸取上清液，勿將固定于孔底的細胞吸出，根據需要加入適量的飼養細胞。
　　⒄于第12、15日加入含有HAT的完全1640培養液。在每次換液前用倒置顯微鏡觀察，大約在10天左右就可觀察到雜交瘤細胞生長出來。大多數雜交瘤細胞在10~20天內出現，但也有在1個月左右才能出現的。雜交瘤細胞出現后，吸取上清液，檢查抗體。
　　⒅對繼續生長的雜交瘤細胞進行增殖傳代。在傳代過程中，依情況取消HAT液和完全1640液而代之以10%FCS－1640液。同時保存于液氮和進行克隆化，在這期間每代都要檢查抗體，以防止產生抗體細胞的變異和丟失。
　　（三）細胞融合的關鍵
　　1．技術上的誤差常常導致融合的失敗。例如，供者**細胞沒有查到**應答。這必然要失敗的。
　　2．融合試驗*大的失敗原因是污染，融合成功的關鍵是提供一個干凈的環境，以及適宜的無菌操作技術。

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