基因編輯技術(shù)在植物中的開發(fā)和應(yīng)用，為分子設(shè)計育種帶來了變化。基于基因編輯技術(shù)建立基因精細(xì)調(diào)控的方法對于精準(zhǔn)設(shè)計育種至關(guān)重要。目前應(yīng)用*廣泛的基因表達(dá)調(diào)控方法如CRISPR-Cas、CRISPRi和RNAi等技術(shù)，只能實現(xiàn)對基因的完全敲除或?qū)⒒虻谋磉_(dá)抑制到不可預(yù)測的水平。利用CRISPR-Cas9技術(shù)對啟動子區(qū)域進(jìn)行編輯，可以在轉(zhuǎn)錄層面將基因的表達(dá)調(diào)控至不同的水平，并產(chǎn)生大量不可預(yù)測的數(shù)量性狀變異。而這種方法將耗費大量精力用以篩選理想的突變體。因此，開發(fā)新的能夠可預(yù)測地精細(xì)調(diào)控基因表達(dá)的方法可以拓展現(xiàn)有的基因表達(dá)調(diào)控工具箱，為作物遺傳改良提供有力的技術(shù)支撐。 

上游開放閱讀框（upstream open reading frame，uORF）是真核生物mRNA上普遍存在的翻譯調(diào)控元件，對基因主效開放閱讀框（primary open reading frame，pORF）的翻譯具有抑制作用。2018年，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞研究組率先利用CRISPR-Cas9技術(shù)對uORF進(jìn)行編輯，建立了精細(xì)上調(diào)內(nèi)源基因翻譯的方法，并利用該方法培育出維生素C含量顯著提高的生菜種質(zhì)（Zhang et al., Nat. Biotechnol., 2018；Si et al., Nat. Protoc., 2020）。2020年，高彩霞研究組將這一技術(shù)應(yīng)用于草莓的遺傳改良，獲得了梯度糖分的系列草莓新種質(zhì)（Xing et al., Genome Biol., 2020）。近日，高彩霞研究組基于既往研究，進(jìn)一步開發(fā)出能夠可預(yù)測地精細(xì)下調(diào)目標(biāo)基因蛋白表達(dá)的新方法。 

uORF的長度及uORF與pORF之間的距離等多種因素均影響uORF對pORF翻譯的抑制能力。因此，研究設(shè)想可通過以下兩種策略抑制目標(biāo)基因的翻譯：一是在目標(biāo)基因的5’ 非翻譯區(qū)（5' untranslated region, 5’ UTR）從頭產(chǎn)生新的uORF；二是原位突變內(nèi)源uORF的終止密碼子以延伸其表達(dá)框長度。原生質(zhì)體瞬時系統(tǒng)的結(jié)果表明，這兩種策略可以有效地將pORF的翻譯抑制到不同的水平，且對其mRNA的表達(dá)量幾乎沒有影響。此后，研究利用堿基編輯和引導(dǎo)編輯系統(tǒng)獲得了含有新創(chuàng)制uORF或內(nèi)源uORF被延伸的水稻突變體植株，通過對突變體植株的蛋白表達(dá)水平和表型進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)突變體中引入的uORF變體對目標(biāo)蛋白表達(dá)和表型的影響與瞬時系統(tǒng)結(jié)果一致。 

為了實現(xiàn)對目標(biāo)基因的表達(dá)進(jìn)行連續(xù)的梯度下調(diào)，本研究結(jié)合以上兩種策略，分別在水稻的OsTCP19、OsTB1和OsDLT基因的5’ UTR區(qū)域設(shè)計了一系列具有不同抑制能力的uORFs，瞬時系統(tǒng)的結(jié)果表明pORF的翻譯水平被梯度地抑制到了原始水平的2.5-84.9%，實現(xiàn)了對基因的梯度敲降。OsDLT基因編碼GRAS蛋白家族成員，參與水稻油菜素內(nèi)酯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)控水稻株高、分蘗數(shù)、種子大小等多個重要農(nóng)藝性狀。該研究以O(shè)sDLT基因為靶標(biāo)，通過編輯OsDLT基因的5’ UTR，獲得了一組具有不同葉夾角、株高和分蘗數(shù)的突變體，且突變體的表型變化趨勢與瞬時系統(tǒng)預(yù)測結(jié)果一致。 

該研究通過對uORF進(jìn)行設(shè)計，開發(fā)了一種普適的能夠可預(yù)測地精細(xì)下調(diào)基因表達(dá)的新方法，為未來的分子設(shè)計育種提供了重要的技術(shù)手段。3月9日，相關(guān)研究成果在線發(fā)表在Nature Biotechnology上（DOI：10.1038/s41587-023-01707-w）。研究工作得到國家重點研發(fā)計劃、中科院、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部等的支持。 

通過編輯uORF培育具有目標(biāo)性狀的水稻植株。（a、b）從頭創(chuàng)制新的uORFs（a）或延伸內(nèi)源uORFs（b）抑制目標(biāo)基因的蛋白表達(dá)；（c）通過產(chǎn)生一系列具有不同抑制能力的uORFs梯度下調(diào)基因的表達(dá)；（d、e）含有uORFs變體的突變體對油菜素內(nèi)酯的敏感性（d）和植株表型（e）。