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引物合成過程

目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。DNA合成儀有很多種，主要都是由ABI/PE公司生產(chǎn)，而Bioneer自行研制的**384并行高通量DNA合成儀，可實(shí)現(xiàn)99%的高合成率。無論采用什么機(jī)器合成，合成的原理都相同，主要差別在于合成產(chǎn)率的高低，試劑消耗量的不同和單個(gè)循環(huán)用時(shí)的多少。

亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點(diǎn)。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相鄰的核苷酸通過3′→5′磷酸二酯鍵連接。

**步，將預(yù)先連接在固相載體CPG上的活性基團(tuán)被保護(hù)的核苷酸與三***反應(yīng)，脫去其5′-羥基的保護(hù)基團(tuán)DMT，獲得游離的5′-羥基。

**步，合成DNA的原料，亞磷酰胺保護(hù)核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3′端被活化，5′-羥基仍然被DMT保護(hù)，與溶液中游離的5′-羥基發(fā)生縮合反應(yīng)。

第三步，帶帽(capping)反應(yīng)，縮合反應(yīng)中可能有極少數(shù)5′-羥基沒有參加反應(yīng)(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)，這種短片段可以在純化時(shí)分離掉。

第四步，在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯。

經(jīng)過以上四個(gè)步驟，一個(gè)脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三***脫去它的5′-羥基上的保護(hù)基團(tuán)DMT，重復(fù)以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去。合成過程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率。

通過氨水高溫處理，連接在CPG上的引物被切下來，通過OPC,PAGE等手段純化引物，成品引物用C18濃縮、脫鹽，沉淀。沉淀后的引物用水懸浮，測(cè)定OD260定量，根據(jù)定單要求分裝。

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