引物設計有 3條基本原則：引物與模板的序列要嚴格互補；兩條引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構；引物不能在模板的非目的位點引發DNA聚合反應(即錯配)。

    在引物的設計過程中，引物長度、產物長度、序列 Tm值、引物與模板形成雙鏈的內部穩定性、形成引物二聚體(primer dimer)及發夾結構（duplex formation andhairpin）的能值、錯配位點（false priming site）的引發效率、引物及產物的GC含量（composition）等均會對PCR反應效率產生影響，因此引物設計應遵循以下幾個原則：

1.  引物的長度一般為 15-30 bp，常用的是 18-27 bp，但不應大于38bp，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進行反應。

2.  引物序列在模板內（尤其是 3’端）應當沒有相似性較高，否則容易導致錯配。引物 3’端出現3個以上的連續堿基，如 GGG或 CCC，也會使錯誤引發的機率增加。

3.  引物 3’端的末位堿基對 Taq 酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導致不同的擴增效率，末位堿基為 A 的錯配效率明顯高于其它 3個堿基，因此應當避免在引物的 3’端使用堿基A。另外，引物二聚體或發夾結構也可能導致 PCR反

應失敗。5’端序列對 PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物。

4.  引物序列的 GC 含量一般為 40-60%，過高或過低都不利于引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。

5.  引物所對應模板位置序列的 Tm值在 72℃左右可使復性條件*佳。Tm值的計算有多種

方法， 如按公式 Tm＝4(G+C)＋2(A+T)， 在 Oligo軟件中使用的是*鄰近法。

6.  ?G 值是指 DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩定

性。應當選用 3’端 ?G 值較低（**值不超過 9） ，而 5’端和中間 ?G 值相對較高的引

物。引物的 3’端的 ?G值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發 DNA 聚合反應。 

7.  引物二聚體及發夾結構的能值過高（超過 4.5kcal/mol）易導致產生引物二聚體帶，并且

降低引物有效濃度會使 PCR 反應不能正常進行。

8.  對引物的修飾一般是在 5’端增加酶切位點，應根據載體的相應序列而確定。

    值得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；在用作克隆目的的 PCR因為產物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。